聽老師將講HPLC的計(jì)算

                                                           檢(jiǎn)碩(shuò)科學器(qì)材（上海(hǎi)）有限(xiàn)公司(sī)

HPLC中(zhōng)涉(shè)及(jí)到計算的，主要是流(liú)動相(xiāng)配(pèi)製和含(hán)量計算。RP-HPLC一(yī)般用(yòng)緩衝(chōng)鹽配(pèi)合甲(jiǎ)醇(chún)乙(yǐ)腈(jīng)作(zuò)為流動相，計算(suàn)主(zhǔ)要(yào)涉及到(dào)如何(hé)配製流動(dòng)相的問題(tí)。同(tóng)時還(huán)要(yào)考慮(lǜ)到流(liú)動相配(pèi)製的(dí)數(shù)量問題。HPLC計(jì)算主要運用(yòng)外(wài)標(biāo)法(fǎ)。內(nèi)標(biāo)法在(zài)HPLC分析(xī)中(zhōng)，運用不多(duō)。所(suǒ)以略講。

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1，流動相配製的(dí)計算

流動(dòng)相(xiāng)在HPLC中起到運(yùn)輸(shū)樣(yàng)品的作(zuò)用(yòng)。而流動(dòng)相準(zhǔn)確地(dì)配(pèi)製(zhì)，在HPLC測(cè)試中(zhōng)有著(zhuó)重(zhòng)要的作用(yòng)。準確地(dì)配製(zhì)流動相(xiāng)能夠保證測試中(zhōng)保留(liú)時間的(dí)重(zhòng)復性。所(suǒ)以(yǐ)，配(pèi)製起(qǐ)來不能掉以(yǐ)輕(qīng)心(xīn)。

對於(yú)流動(dòng)相配製(zhì)，我(wǒ)把(bǎ)它概括(kuò)為以(yǐ)下(xià)幾個字(zì)。

計算，稱量(liáng)，溶(róng)解(jiě)，調節(jié)，<混(hùn)合>，過濾(lǜ)，脫(tuō)氣。為(wéi)什麼我把“混(hùn)合"外加(jiā)了個框呢？這就是(shì)涉(shè)及到你的(dí)設(shè)備(bèi)是否(fǒu)是(shì)單元(yuán)泵(bèng)還是(shì)多元(yuán)泵(bèng)的(dí)問(wèn)題(tí)了(liǎo)。如(rú)果隻有(yǒu)一台(tái)單(dān)元泵(bèng)，也(yě)無電(diàn)磁閥切換功(gōng)能的(dí)泵，需要混合這個步驟(zhòu)，而多元泵，或者(zhě)低(dī)壓梯(tī)度切換的，可(kě)以不需要所(suǒ)謂的混(hùn)合(hé)。各走各(gè)的。

打(dǎ)個(gè)比方說(shuō)，如果(guǒ)我的流(liú)動相(xiāng)是：甲(jiǎ)醇：純水=60：40（v/v），對(duì)於單元泵(bèng)，那麼隻能甲(jiǎ)醇和(hé)純水混合，作(zuò)為流動(dòng)相(xiāng)，而多(duō)元泵或(huò)者多(duō)元梯度泵(bèng)，則可以有(yǒu)兩路，A路放甲(jiǎ)醇(chún)， B路(lù)放(fàng)純水，A與B各比例(lì)控製為60%，和40%。

對於HPLC 配(pèi)製流動相，要保證(zhèng)流(liú)動(dòng)性(xìng)配(pèi)製準確，也要(yào)保(bǎo)證(zhèng)流動相(xiāng)配製足(zú)量，不(bù)多(duō)不少，這(zhè)樣保(bǎo)證在這批(pī)測試中，流動相不至於不(bù)夠，也(yě)不致(zhì)於太(tài)多而(ér)浪費，流(liú)動(dòng)相一(yī)般(bān)需要在(zài)2-3天內用(yòng)完。那(nà)麼首先確定(dìng)流動相(xiāng)要配(pèi)製多(duō)少。舉一個例子(zǐ)。

例

要分析(xī)30個樣品，10個(gè)對(duì)照品(pǐn)，樣品(pǐn)和(hé)對照品(pǐn)都分(fēn)析(xī)2次。一個試樣分析20分鐘，流(liú)速(sù)為1.2ml/min。那(nà)麼我要配製多(duō)少ml的(dí)流動相(xiāng)呢？通過計(jì)算(suàn)來(lái)解決。（注(zhù)：自動(dòng)進樣(yàng)，連(lián)夜分(fēn)析，可(kě)以設(shè)置(zhì)停止(zhǐ)泵(bèng)程序）

一般來說(shuō)，試(shì)樣(yàng)設置(zhì)20分鐘，還(huán)需(xū)要(yào)考(kǎo)慮(lǜ)進樣的(dí)時間(jiān)。假(jiǎ)設進樣時間為三分鐘(zhōng)，那(nà)麼一(yī)個試(shì)樣所(suǒ)需(xū)要(yào)的(dí)時間為(wéi)23分(fēn)鐘(zhōng)。我們可以計(jì)算(suàn)：

根據(jù)計算，需要配製(zhì)2208ml流動(dòng)相。對於流(liú)動相(xiāng)，我(wǒ)們不(bù)能配製(zhì)得(dé)太摳，需要(yào)考慮(lǜ)到(dào)吸濾頭占的(dí)空(kōng)間(jiān)，那(nà)麼(mó)我(wǒ)們再多配(pèi)製個(gè)100-300ml，這取決於你的瓶底(dǐ)胖瘦(shòu)。能夠(gòu)保(bǎo)證不被吸(xī)空為宜(yí)。那(nà)麼(mó)我們就配製2500ml吧(bā)。

對於流動相(xiāng)如何配製，我們(mén)給一個(gè)實(shí)例

比(bǐ)如我要測試中(zhōng)藥一清(qīng)膠(jiāo)囊，我們(mén)翻(fān)閱(yuè)中國藥典，得(dé)以下(xià)信(xìn)息(xī)。

一清(qīng)顆(kē)粒(lì)是(shì)由黃連，大(dà)黃(huáng)，黃芩(qín)（qin）組成。一般(bān)用於(yú)清(qīng)熱(rè)瀉火(huǒ)解(jiě)毒(dú)，化瘀涼(liáng)血止血。用(yòng)於火毒血(xiě)熱(rè)所導致的身熱(rè)煩躁，目赤口瘡(chuāng)，咽喉(hóu)牙齦(yín)腫痛(tòng)，大便秘(mì)結(jié)，吐血(xiě)，咯(kǎ)血(xiě)咽(yān)喉炎(yán)，扁桃體(tǐ)炎，牙齦(yín)炎等上述症候(hòu)者(zhě)。

其(qí)中黃芩主要(yào)成(chéng)分(fēn)黃(huáng)芩苷用HPLC方(fāng)法測試(shì)。先(xiān)摘(zhāi)入如下：

色譜條件與(yǔ)係統適(shì)應(yīng)性試驗以(yǐ)十八(bā)烷基矽烷鍵合矽(guī)膠(jiāo)為填充劑(jì)，以(yǐ)甲醇-0.2mol/L磷酸二氫(qīng)鈉溶(róng)液(yè)（pH=2.7）(42:58 v/v)為流動(dòng)相，檢(jiǎn)測波長為(wéi)275nm。有效塔板(bǎn)數按(àn)黃芩(qín)苷(gān)峰(fēng)計(jì)算不(bù)低於(yú)5000

我(wǒ)們看到，其流動(dòng)相(xiāng)是：甲(jiǎ)醇-0.2mol/L磷酸(suān)二氫鈉溶(róng)液(yè)（pH=2.7）(42:58 v/v)，那(nà)麼也(yě)就(jiù)是說(shuō)有(yǒu)水相(xiāng)識0.2mol/L磷(lín)酸(suān)二氫鈉溶(róng)液，其(qí)pH=2.7（用磷酸(suān)調節），有機(jī)相是甲醇。

要注意，對於(yú)HPLC用的試劑，水，溶(róng)劑，都是需(xū)要好的(dí)。試(shì)劑(jì)一(yī)般(bān)在(zài)分析純(chún)以上(shàng)。最好用(yòng)優級純，溶劑一(yī)般(bān)用(yòng)HPLC級(jí)別(bié)。水(shuǐ)用(yòng)超純水。所(suǒ)有(yǒu)的溶(róng)劑，溶液，都需要用(yòng)0.45微米（或更(gēng)細）的(dí)微(wēi)孔(kǒng)濾(lǜ)膜(mó)濾過。也(yě)要(yào)保證溶劑(jì)瓶(píng)清洗(xǐ)幹(gān)淨。幹(gān)燥(zào)。

流動相(xiāng)脫氣(qì)是(shì)很重要的(dí)，現(xiàn)在一般(bān)的(dí)儀器都有(yǒu)在綫脫氣(qì)。當(dāng)然，在(zài)配(pèi)製(zhì)流動相前脫氣，亦(yì)重要(yào)。一(yī)般脫(tuō)氣(qì)又抽(chōu)真(zhēn)空脫氣(qì)，超(chāo)聲(shēng)波(bō)脫(tuō)氣，吹(chuī)He脫(tuō)氣(qì)，加熱回流(liú)脫氣等(děng)。常用的是(shì)前(qián)兩(liǎng)個脫(tuō)氣(qì)方法。當然(rán)，抽真空脫氣效(xiào)率比較(jiào)高，但是(shì)要(yào)注意(yì)有(yǒu)機相是否在(zài)抽(chōu)真空後(hòu)比(bǐ)例(lì)改變的(dí)問題(tí)。所以，對於(yú)混(hùn)合兩相(xiāng)的流動相(xiāng)，最好單獨(dú)濾(lǜ)過，再混(hùn)合。混(hùn)合後一般(bān)會產生氣體(tǐ)，用效率略(lüè)低的超聲(shēng)波脫氣(qì)即可(kě)。超聲(shēng)波(bō)脫氣，隻要看到(dào)無明顯(xiǎn)氣泡(pào)即(jí)可(kě)使用。

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二．含量計算

對(duì)於HPLC，我(wǒ)們(mén)一(yī)般(bān)使(shǐ)用外(wài)標(biāo)法計算。那麼(mó)有(yǒu)同學問，那(nà)麼為(wéi)什麼內標法(fǎ)很少在(zài)HPLC上(shàng)使用呢(ní)?

那麼(mó)我們(mén)看下氣(qì)相色(sè)譜和HPLC不(bù)同的(dí)進樣方式。GC手(shǒu)動進(jìn)樣(yàng)還是依(yī)靠進樣(yàng)針(zhēn)的(dí)定量進樣，因為(wéi)進樣量很(hěn)少(shǎo)，以(yǐ)微(wēi)升計(jì)，所以，稍(shāo)稍不留神(shén)，就有(yǒu)可能(néng)多(duō)進或者少(shǎo)進樣(yàng)。而(ér)且(qiě)，進(jìn)樣(yàng)針上(shàng)的(dí)刻(kè)度也很(hěn)粗(cū)，所以(yǐ)，GC用手動進樣(yàng)，使用(yòng)外標(biāo)法確(què)實很考(kǎo)驗測(cè)試者(zhě)的(dí)嫻(xián)熟(shú)技巧和過人的(dí)眼力。而內標法在(zài)GC進樣測試(shì)中(zhōng)，由於(yú)內標(biāo)物(wù)的調節(jié)作用(yòng)，可以使(shǐ)得(dé)由於進樣誤(wù)差降低到(dào)最小，其相關的(dí)文(wén)章(zhāng)，查閱qinqingcao在(zài)本(běn)論壇的(dí)文章(zhāng)。但是HPLC進樣是六通閥(fá)進(jìn)樣，其(qí)有一根定量環，如(rú)果手動(dòng)進樣能(néng)夠(gòu)保證(zhèng)定(dìng)量環(huán)是(shì)充滿(mǎn)樣品(pǐn)溶(róng)液的，那麼(mó)進(jìn)樣(yàng)誤差就幾乎(hū)不存在。況(kuàng)且(qiě)內(nèi)標法需要尋(xún)找合(hé)適的(dí)內(nèi)標物(wù)質，同(tóng)時(shí)配製內標(biāo)物(wù)，比較(jiào)麻煩(fán)，所(suǒ)以在HPLC中(zhōng)很(hěn)少聽(tīng)說(shuō)用內標法定量計算(suàn)。更多(duō)的，是使(shǐ)用(yòng)外(wài)標法計算。

所(suǒ)以(yǐ)，HPLC手動(dòng)進樣(yàng)一(yī)般使(shǐ)用(yòng)3倍量的定量環進(jìn)樣。也(yě)就是說，20微(wēi)升(shēng)的(dí)定(dìng)量環，我要注入60微(wēi)升(shēng)以上的樣品溶(róng)液。保證定量環中充(chōng)滿(mǎn)著樣(yàng)品溶(róng)液。而(ér)多(duō)餘的(dí)樣品溶液會被排(pái)除(chú)。這樣(yàng)保(bǎo)證每(měi)次(cì)進樣(yàng)都是定(dìng)量(liáng)環中的(dí)那(nà)些量(liáng)。對於定(dìng)量(liáng)環，這(zhè)個(gè)體積一般也(yě)不(bù)是正好(hǎo)是20.00微升(shēng)，但是我(wǒ)們保證(zhèng)進(jìn)樣過(guò)量（多餘的(dí)溶(róng)液(yè)會(huì)被(bèi)排(pái)出），則能夠保(bǎo)證(zhèng)進(jìn)樣都是按照定(dìng)量環中(zhōng)的體(tǐ)積進入(rù)色譜(pǔ)係統，這樣(yàng)消(xiāo)除進(jìn)樣(yàng)的誤差(chà)。對於定(dìng)量環，在(zài)做完樣(yàng)品(pǐn)後(hòu)需要用(yòng)無溶(róng)質(zhì)的(dí)流動相清洗數(shù)遍。如果定量(liáng)環真(zhēn)的(dí)很髒，無法(fǎ)清洗了(liǎo)，那麼可以(yǐ)裁剪一段管徑(jìng)和定量環相(xiāng)同的(dí)幹淨(jìng)的(dí)不(bù)鏽(xiù)鋼管，裁剪長度和定量管(guǎn)相(xiāng)同(tóng)，安(ān)裝上(shàng)去。當(dāng)然資金充(chōng)裕的話，也(yě)可以購(gòu)買廠家的定(dìng)量環(huán)。

當然(rán)現(xiàn)在自(zì)動進樣器(qì)很(hěn)普(pǔ)及，那麼使(shǐ)用自動進(jìn)樣器(qì)就(jiù)更(gēng)加方(fāng)便(biàn)了(liǎo)。

對(duì)於外標法，實(shí)際(jì)上也就是用(yòng)已知(zhī)濃(nóng)度(dù)的(dí)對照品（標準(zhǔn)品(pǐn)）來(lái)對(duì)樣(yàng)品中的該(gāi)物質。這實際(jì)上(shàng)很象(xiàng)砝(fǎ)碼和天平。標準(zhǔn)品就如(rú)同(tóng)砝(fǎ)碼，在同樣的色譜(pǔ)條件下(xià)，標(biāo)準品(pǐn)的峰麵(miàn)積和濃(nóng)度已知(zhī)，而樣(yàng)品中的(dí)峰(fēng)麵(miàn)積可(kě)以測(cè)試(shì)出(chū)來(lái)，這(zhè)樣(yàng)通(tōng)過比(bǐ)例式子比較出樣品(pǐn)中(zhōng)該(gāi)物質(zhì)的濃(nóng)度了。

在這裏，我(wǒ)想(xiǎng)和大(dà)家說明的是(shì)，一般(bān)是(shì)通(tōng)過(guò)保留(liú)時(shí)間做定性(xìng)的(dí)。比(bǐ)方說(shuō)，我(wǒ)測(cè)試(shì)維(wéi)生素(sù)C，維生素C標準品在(zài)一(yī)定(dìng)的色(sè)譜條(tiáo)件(jiàn)下，其(qí)保留時(shí)間為2.4分鐘；樣品在同樣的色(sè)譜(pǔ)條(tiáo)件(jiàn)下(xià)，2.4分(fēn)鐘有峰(fēng)，一(yī)般認為是(shì)樣品中也(yě)許有(yǒu)維生素C。當然，保留(liú)時(shí)間定(dìng)性(xìng)確(què)實有(yǒu)其局限(xiàn)，但(dàn)是(shì)沒有其他手段，那(nà)麼保(bǎo)留(liú)時(shí)間還(huán)是能夠發(fā)揮定(dìng)性的(dí)作用。

對於定量，外標法(fǎ)定量，如果做(zuò)的準確(què)的(dí)話，需(xū)要用多點(diǎn)（濃度(dù)）定(dìng)量(liáng)。然而(ér)在(zài)企業(yè)用(yòng)單點(diǎn)法定量還(huán)是很(hěn)多(duō)的(dí)。對於(yú)做(zuò)綫性(xìng)，精(jīng)密(mì)度，回收率，這些內(nèi)容(róng)我(wǒ)們在方法(fǎ)學驗證(zhèng)中(zhōng)講授，這裏我還是著重(zhòng)講解單(dān)點(diǎn)法校正。

在(zài)講單點法(fǎ)校正(zhèng)，我(wǒ)先(xiān)問(wèn)同(tóng)學(xué)們(mén)一個(gè)問題(tí)，如何用簡(jiǎn)單(dān)的方法(fǎ)來(lái)測試校園中(zhōng)的樹高度？

通(tōng)過一(yī)根已(yǐ)知高度的biao杆(gān)，在太(tài)陽(yáng)下(xià)投射在地麵的(dí)陰(yīn)影的長(cháng)度(dù)，計算(suàn)出(chū)樹的高度。同(tóng)樣道理(lǐ)，我(wǒ)們也是(shì)用已知的(dí)標準品的濃(nóng)度和(hé)峰麵積，用樣品中(zhōng)同(tóng)一物(wù)質(zhì)的麵(miàn)積(jī)，計算出樣品中的(dí)那個(gè)物質的(dí)濃度(dù)。根(gēn)據稀(xī)釋倍數計(jì)算(suàn)出樣(yàng)品(pǐn)中(zhōng)，該物質(zhì)的含(hán)量。

如果與(yǔ)標準(zhǔn)曲綫(xiàn)聯(lián)係(xì)起來，這個就是(shì)單點(diǎn)法。也(yě)就是(shì)說，以0為圓心(xīn)，標準品濃度(dù)和麵積在(zài)二(èr)元(yuán)坐標的一點的連綫作(zuò)為(wéi)校準(zhǔn)曲綫。得(dé)y=ax 其中的a就是斜(xié)率，也就是麵積(jī)隨(suí)著(zhuó)濃度的變化(huà)而變化(huà)，其變化率(shuài)為a。

那麼(mó)樣(yàng)品濃(nóng)度的(dí)計算，就是按照(zhào)其(qí)峰麵(miàn)積在坐標(biāo)上的(dí)點(diǎn)，對應(yīng)的濃(nóng)度。用以下(xià)公(gōng)式計算(suàn)。

單(dān)點法(fǎ)：

我(wǒ)們(mén)給(gěi)出(chū)一(yī)個(gè)例(lì)題。

例(lì)

測試果(guǒ)汁中維(wéi)生(shēng)素C含(hán)量(liáng)。配製20mg/100ml的維(wéi)生(shēng)素C作(zuò)為標準品。稱(chēng)取20.005g果汁(zhī)到(dào)50ml容(róng)量(liáng)瓶中(zhōng)，加(jiā)入流(liú)動相溶(róng)解定(dìng)容搖(yáo)匀(yún)。濾紙(zhǐ)過濾。吸(xī)取濾(lǜ)液10ml到(dào)50ml容(róng)量(liáng)瓶中(zhōng)。流(liú)動相定(dìng)容(róng)搖匀。標(biāo)準(zhǔn)品和樣(yàng)品(pǐn)均吸取20μl進色譜，分別得到(dào)峰(fēng)麵積(jī)24336（標準(zhǔn)品），20129（樣品(pǐn)）。計(jì)算果汁(zhī)中(zhōng)維生素(sù)C含量（mg/100g）

                                                                                                                                       本篇轉(zhuǎn)載至(zhì)液(yè)相色譜(pǔ)之家