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凍幹保護(hù)劑(jì)在蛋(dàn)白(bái)藥(yào)物中起了(liǎo)什(shí)麼(mó)作(zuò)用(yòng)

冷凍幹燥(zào)廣泛(fàn)用(yòng)於(yú)製備治療性蛋白質(zhì)製(zhì)劑(jì)，蛋白凍幹製劑可以提供更好(hǎo)的(dí)保質(zhì)期(qī)，方便藥物的儲藏和運輸，然(rán)而(ér)，蛋(dàn)白在凍幹(gān)過(guò)程中(zhōng)存在(zài)許(xǔ)多應力，包(bāo)括低溫(wēn)應力，凍結應力(lì)(枝狀冰晶(jīng)的(dí)形成(chéng)，離子強(qiáng)度(dù)的(dí)增(zēng)加，pH值的改(gǎi)變，相(xiāng)分離等(děng))，幹(gān)燥(zào)應力(失去蛋(dàn)白質表(biǎo)麵水分子(zǐ))等，這些應(yīng)力常(cháng)常(cháng)直接或間接(jiē)導(dǎo)致蛋白(bái)質類藥(yào)物(wù)失去(qù)天然構象(xiàng)從(cóng)而變(biàn)性(xìng)或(huò)失活。

冷(lěng)凍幹燥(zào)保護劑的分類方(fāng)式很(hěn)多(duō)，有文獻(xiàn)中(zhōng)提出(chū)了(liǎo)一個公(gōng)式化模型(xíng)，按照(zhào)功(gōng)能把冷(lěng)凍幹(gān)燥保(bǎo)護(hù)劑分類(lèi)，包(bāo)括5類(lèi):

①pH緩衝(chōng)劑(jì)，如(rú)Tris，組氨酸，枸(jǔ)櫞酸等(děng);

②配(pèi)體(tǐ)，可以優化蛋(dàn)白質(zhì)的熱力學穩(wěn)定(dìng)性(xìng);

③穩定(dìng)劑，一般(bān)是(shì)雙(shuāng)糖，如(rú)蔗糖，海藻糖(táng)等(děng)，可通(tōng)過抑製(zhì)蛋(dàn)白質的展開和(hé)提供玻璃基(jī)質起(qǐ)保(bǎo)護(hù)作(zuò)用;

④非(fēi)離(lí)子表(biǎo)麵活性劑，可減(jiǎn)少蛋白質的聚集;

⑤填(tián)充(chōng)劑(jì)，如(rú)甘露醇，甘氨(ān)酸，***澱(diàn)粉(fěn)，血清白蛋(dàn)白(bái)等(děng)，可(kě)提高(gāo)產品的物理成型性(xìng)。這裏(lǐ)我們(mén)簡要介紹其(qí)中幾種。

1，緩衝(chōng)鹽

首先，蛋(dàn)白(bái)質穩(wěn)定(dìng)性(xìng)受環境(jìng)pH的影(yǐng)響(xiǎng)，緩(huǎn)衝液選擇(zé)在(zài)蛋白(bái)質(zhì)製劑(jì)的開發過(guò)程中是最關鍵的，並(bìng)且(qiě)必須在配(pèi)製(zhì)階段建立。在選擇緩衝液pH時(shí)，建議pH不(bù)要(yào)太(tài)接近(jìn)蛋白質(zhì)的(dí)pI(等(děng)電點(diǎn))以避免聚集(jí)。

磷酸鹽是(shì)蛋(dàn)白(bái)質(zhì)配(pèi)方中最(zuì)常見的緩(huǎn)衝(chōng)劑之(zhī)一(yī)，特別是(shì)含(hán)水蛋白(bái)質(zhì)藥物，有(yǒu)效pH值(zhí)範圍為(wéi)5.8-8.0，並(bìng)且具(jù)有(yǒu)生(shēng)物相容性。然而，正如“冷凍過(guò)程中(zhōng)的pH變化"所(suǒ)討論(lùn)的那(nà)樣，磷酸鹽緩衝(chōng)液(yè)，特別是(shì)磷酸氫二鈉，在冷(lěng)凍過(guò)程中會(huì)發生顯著(zhuó)的pH變化，因(yīn)此(cǐ)不(bù)推(tuī)薦用(yòng)於(yú)pH敏(mǐn)感蛋白(bái)質(zhì)。

相(xiāng)反，磷酸(suān)鉀，組氨(ān)酸，三(sān)羥(qiǎng)甲基(jī)氨(ān)基(jī)甲烷(Tris)和檸檬酸(suān)鹽緩衝(chōng)液在冷凍(dòng)期(qī)間顯示出最(zuì)小(xiǎo)的pH變(biàn)化(huà)。此外(wài)，低(dī)緩(huǎn)衝液濃(nóng)度(dù)可有助於降(jiàng)低pH變化(huà)。組(zǔ)氨酸是(shì)一種(zhǒng)氨(ān)基(jī)酸，有效pH範圍(wéi)為5.5-7.4，它與(yǔ)生物(wù)pH相容(róng)，並(bìng)且(qiě)經(jīng)常(cháng)用(yòng)於冷凍幹燥的蛋白質。然(rán)而(ér)，選(xuǎn)擇(zé)適當(dāng)的冷凍幹(gān)燥水性(xìng)製劑(jì)，包(bāo)括(kuò)緩(huǎn)衝(chōng)劑，取決(jué)於(yú)蛋(dàn)白質(zhì)的要求及(jí)其給藥(yào)途徑(jìng)。

2，填(tián)充劑

為了保證冷凍(dòng)幹燥(zào)後形(xíng)成良好的配(pèi)方結構(gòu)防(fáng)止(zhǐ)產品塌陷，同時改善配(pèi)方溶(róng)解性，冷(lěng)凍(dòng)幹燥(zào)保(bǎo)護(hù)劑中還需要加(jiā)入(rù)填充(chōng)劑(jì)。首先，填充劑在復溶(róng)時(shí)應該(gāi)是(shì)充分(fēn)可(kě)溶(róng)的並且與製劑(jì)中的(dí)蛋(dàn)白(bái)質藥(yào)物相(xiāng)容(róng)。此外，它們沒(méi)有毒性問題並(bìng)且具(jù)有高(gāo)共(gòng)晶/共熔溫(wēn)度(Teu)，可有(yǒu)效提高冷(lěng)凍(dòng)幹(gān)燥效(xiào)率。

甘氨(ān)酸(suān)和(hé)甘露(lòu)醇經常用作(zuò)凍幹(gān)蛋(dàn)白(bái)質製劑的填充(chōng)劑(jì)。甘(gān)氨酸在(zài)用作(zuò)填充劑(jì)時(shí)具有優勢(shì)，因為它是無毒的。它(tā)具有高共晶(jīng)/共(gòng)熔(róng)溫度(Teu)，可實現高(gāo)效(xiào)冷凍幹(gān)燥和高(gāo)溶解(jiě)度。

甘(gān)露醇具有(yǒu)與(yǔ)甘(gān)氨酸相(xiāng)同(tóng)的(dí)優(yōu)點(diǎn)，並且(qiě)對特(tè)定(dìng)蛋白(bái)質藥物(wù)如LDH和轉化生(shēng)長因(yīn)子-b1具(jù)有(yǒu)穩(wěn)定(dìng)作(zuò)用，其(qí)穩定效果取(qǔ)決於其濃(nóng)度。因(yīn)此，在選擇(zé)填(tián)充劑時，應仔細考慮穩(wěn)定(dìng)效果以(yǐ)及(jí)粉(fěn)餅外(wài)觀(guān)。大多數氨基(jī)酸容(róng)易(yì)結(jié)晶並(bìng)且可(kě)以潛在地用(yòng)作(zuò)填充(chōng)劑(jì)以(yǐ)穩定(dìng)蛋白質(zhì)，然(rán)而，酸(suān)鹽(yán)的形(xíng)成阻(zǔ)礙了(liǎo)它們的(dí)結晶。NaCl是(shì)另一(yī)種結(jié)晶劑，但(dàn)其(qí)共熔(róng)溫度(Teu)相對於(yú)其他(tā)填(tián)充劑(jì)的而(ér)言(yán)太低，因此不(bù)推薦使(shǐ)用。

對(duì)於填充劑(jì)，應考慮(lǜ)退(tuì)火(huǒ)步(bù)驟。甘氨酸和甘露(lòu)糖醇(chún)在冷凍幹燥(zào)過程(chéng)中(zhōng)應(yīng)以(yǐ)結晶形式(shì)存(cún)在(zài)。但(dàn)是(shì)在(zài)冷凍(dòng)步(bù)驟期間(jiān)，過(guò)冷(lěng)卻誘導兩種填(tián)充劑(jì)以(yǐ)無(wú)定(dìng)形形(xíng)態凍(dòng)結，容(róng)易(yì)導致(zhì)粉餅(bǐng)塌陷。另外，在(zài)沒有退火(huǒ)的情況下(xià)，填(tián)充(chōng)劑(jì)可(kě)以(yǐ)在(zài)初級幹燥期(qī)間重結(jié)晶(jīng)造成西林(lín)瓶破裂，特別是(shì)當製劑中包含高(gāo)濃度的甘(gān)露醇時。填充劑(jì)應在非晶相的玻(bō)璃化(huà)轉變溫度(Tg’)和填(tián)充劑的共熔溫度(dù)(Teu)之(zhī)間進行(háng)有效結晶，而(ér)退火時間(jiān)取(qǔ)決於(yú)填充劑濃度及(jí)其(qí)性(xìng)質。對於甘(gān)露醇(chún)和(hé)甘氨(ān)酸，填(tián)充(chōng)高(gāo)度在(zài)1cm時(shí)，推薦(jiàn)在-20或(huò)-25℃和(hé)2小(xiǎo)時。

3，穩定劑

糖類是凍(dòng)幹(gān)蛋(dàn)白質(zhì)製劑中***的(dí)賦形(xíng)劑，因為它們(mén)的(dí)結構(gòu)中具有(yǒu)許多(duō)羥基(jī)，因(yīn)此可以(yǐ)通過取代(dài)蛋白(bái)質和水(shuǐ)之(zhī)間的氫鍵來(lái)提(tí)供(gōng)穩定效果(guǒ)。此外(wài)，大(dà)多數糖(táng)在正(zhèng)常冷(lěng)凍(dòng)幹(gān)燥條件下不(bù)結晶，導致(zhì)凍幹(gān)蛋白(bái)質製劑更(gēng)快(kuài)速復溶。還(huán)原性糖通(tōng)常(cháng)不用(yòng)於(yú)冷(lěng)凍(dòng)幹燥，因(yīn)為它(tā)們通過(guò)美拉(lā)德反應與(yǔ)蛋白(bái)質(zhì)反(fǎn)應，然(rán)而，當它們(mén)的(dí)穩(wěn)定性(xìng)效(xiào)果優(yōu)於(yú)其(qí)他(tā)賦形劑時(shí)，它們(mén)可以(yǐ)使(shǐ)用。

蔗糖已(yǐ)廣(guǎng)泛用於蛋白質(zhì)製(zhì)劑配方(fāng)，海(hǎi)藻糖被(bèi)認(rèn)為(wéi)是(shì)比蔗(zhè)糖(táng)更(gēng)優異的凍幹保(bǎo)護(hù)劑(jì)，因為它(tā)具有更高(gāo)的(dí)玻(bō)璃化(huà)轉變(biàn)溫度(Tg’)。海藻糖(táng)還(huán)具(jù)有(yǒu)其他(tā)優點(diǎn)，例如低吸濕(shī)性，不(bù)存在內(nèi)部(bù)氫(qīng)鍵(jiàn)，從而(ér)與(yǔ)蛋(dàn)白(bái)質的(dí)氫鍵更(gēng)靈活，化學反應性低。蔗糖(táng)和(hé)海藻糖的高粘度(dù)也可(kě)降低(dī)在(zài)高(gāo)於玻璃化(huà)轉(zhuǎn)變溫度(Tg’)的溫(wēn)度(dù)下幹燥期間的蛋白質變性速率(shuài)，從而提高(gāo)冷凍(dòng)幹燥效(xiào)率(shuài)。

多(duō)元(yuán)醇(chún)廣泛用(yòng)於蛋白質(zhì)穩定劑，因(yīn)為(wéi)它們(mén)可以(yǐ)通過其羥基(jī)穩定(dìng)蛋白(bái)質。多元醇已(yǐ)被(bèi)用作冷凍保護劑(jì)和(hé)凍幹(gān)保(bǎo)護(hù)劑。例如，在凍(dòng)融(róng)期(qī)間，LDH在不同(tóng)程度(dù)上受(shòu)甘油(yóu)，木(mù)糖醇，山(shān)梨糖醇(chún)和(hé)甘露(lòu)醇(chún)的保護(hù)。

聚合(hé)物已被用作(zuò)蛋白質溶(róng)液(yè)和凍幹(gān)製(zhì)劑的(dí)保(bǎo)護劑(jì)。血(xiě)清白蛋白(bái)是用於(yú)蛋白(bái)質(zhì)藥(yào)物開(kāi)發(fā)的較廣泛(fàn)使(shǐ)用(yòng)的聚合(hé)物(wù)之(zhī)一(yī)，作為(wéi)凍幹(gān)保護(hù)劑和(hé)冷凍(dòng)保(bǎo)護(hù)劑(jì)。許多(duō)上市蛋(dàn)白(bái)質(zhì)藥物含(hán)有不同量的白(bái)蛋白(表(biǎo)1)。但是(shì)，血清白(bái)蛋白具(jù)有(yǒu)與(yǔ)血源(yuán)性病原體相(xiāng)關的潛(qián)在汙(wū)染物，限製(zhì)了(liǎo)其(qí)在蛋(dàn)白質藥物製劑中(zhōng)的使(shǐ)用。因此(cǐ)，建議(yì)rHA替(tì)代血清白(bái)蛋(dàn)白。最終(zhōng)，建議在(zài)沒有白(bái)蛋白(bái)的情況(kuàng)下開發(fā)蛋(dàn)白質(zhì)藥物。